成骨细胞增殖分化中的地塞米松和鹿瓜多肽：抑制还是促增殖分化？

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.15.004

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前因地塞米松注射液广泛及长期使用引起的骨质疏松症发病率逐渐升高，但临床尚没有确切的治疗方法，鹿瓜多肽注射液为常用的促进骨折愈合、提高骨密度的药物。
目的：观察鹿瓜多肽注射液在高浓度地塞米松条件下对成骨细胞增殖与分化的影响。
方法：将大鼠成骨细胞随机分成3组，地塞米松+鹿瓜多肽注射液组添加1×10^-7 mol/L地塞米松注射液、8 mg/L 鹿瓜多肽注射液和终浓度为1 g/L的二甲基亚砜；地塞米松组添加与地塞米松+鹿瓜多肽注射液组等量的二甲基亚砜及1×10^-7 mol/L的地塞米松注射液；对照组只添加与地塞米松+鹿瓜多肽注射液组等量的二甲基亚砜。96 h后以RT-PCR分析骨钙素的表达，21 d后茜素红染色对比观察钙结节的表达。
结果与结论：地塞米松+鹿瓜多肽注射液组与对照组骨钙素的mRNA表达量均高于地塞米松组(P < 0.01)，地塞米松+鹿瓜多肽注射液组与对照组钙结节表达量也高于地塞米松组(P < 0.01)，而地塞米松+鹿瓜多肽注射液组与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。提示鹿瓜多肽注射液可对抗高浓度地塞米松对成骨细胞增殖和分化的抑制作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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关键词: 组织构建, 骨组织工程, 地塞米松注射液, 鹿瓜多肽注射液, 糖皮质激素, 成骨细胞, 骨质疏松

Abstract:

BACKGROUND: The incidence of osteoporosis caused by long-term use of dexamethasone injection is increasing, but there is no exact treatment. Lugua peptide injection is a common drug to promote fracture healing and increase bone density.
OBJECTIVE: To observe the effect of Lugua peptide injection plus high-concentration dexamethasone on osteoblast proliferation and differentiation.
METHODS: The rat osteoblasts were randomly divided into three groups. Lugua peptide plus dexamethasone group was injected with 1×10^-7 mol/L dexamethasone, 8 mg/L Lugua peptide and dimethyl sulfoxide (final concentration 1 g/L). Dexamethasone group was injected with 1×10^-7 mol/L dexamethasone and dimethyl sulfoxide (final concentration 1 g/L). Control group was injected with dimethyl sulfoxide (final concentration 1 g/L). After 96 hours, the expression of osteocalcin was analyzed by RT-PCR analysis; at 21 days, the expression of calcium nodules was observed by alizarin red staining.
RESULTS AND CONCLUSION: The osteocalcin mRNA expression and calcium nodule expression in Lugua peptide plus dexamethasone group and control group were higher than that in dexamethasone group (P < 0.01), while there was no significant difference between Lugua peptide plus dexamethasone group and control group (P > 0.05). Lugua peptide injection can prevent the inhibitory effect of high concentrations of dexamethasone on the osteoblast proliferation and differentiation.

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Key words: dexamethasone, glucocorticoids, osteoblasts, osteoporosis, osteocalcin

中图分类号:

R318

段峰，温克寒，王心彧，张国梁，戴辛鹏，郭欢欢. 成骨细胞增殖分化中的地塞米松和鹿瓜多肽：抑制还是促增殖分化？[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(15): 2314-2319.

Duan Feng, Wen Ke-han, Wang Xin-yu, Zhang Guo-liang, Dai Xin-peng, Guo Huan-huan . Dexamethasone and Lugua peptide in osteoblast proliferation and differentiation: inhibitive or promotive effects? [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(15): 2314-2319.

图/表（结果） 4

2.1 PCR检测骨钙素mRNA的表达情况 通过RT-PCR检测各组中骨钙素mRNA的表达。结果如电泳图所示，骨钙素和β-actin的特异性引物均获得了的PCR产物，内参基因β-actin在600-450 bp之间出现明显的DNA条带，且3组之间地塞米松+鹿瓜多肽注射液组、对照组组稍暗，说明无明显差别，而骨钙素出现在300-450 bp之间(图1)，地塞米松+鹿瓜多肽注射液组、对照组之间无明显差别，地塞米松组较地塞米松组骨钙素的mRNA的表达水平较地塞米松+鹿瓜多肽注射液组、对照组组骨钙素的表达水平弱，受到了影响，且地塞米松+鹿瓜多肽注射液组中无显著影响。

利用凝胶成像系统软件对图像进行电泳条带的吸光度值测定并进行方差分析，目的基因骨钙素mRNA与内参基因β-actin吸光度的比值见表1，地塞米松+鹿瓜多肽注射液组、对照组骨钙素的mRNA表达量均高于地塞米松组(P < 0.01)，且地塞米松+鹿瓜多肽注射液组与对照组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.2 钙结节染色情况 培养14，21 d时钙结节的相对表达量以及图像由Image-Pro Plus处理分析。地塞米松+鹿瓜多肽注射液组、地塞米松组、对照组细胞从第三至四日开始，可见细胞逐渐由长梭形成长为立方体，然后转变为多角形，随着时间的增长，细胞增殖加快，细胞逐渐聚集慢慢地形成岛状细胞结构(图2)。随着时间延长细胞分泌的基质逐渐将岛状细胞包埋，在14 d时各组细胞密集处有红色的椭圆形、圆形、形状大小不一、或形状不规则的沉着物，呈团状弥散到四周，中心颜色较暗，各浓度没有明显差异。随着培养时间的延长，21 d时有较多的形态不一红色钙盐沉积形成的红色钙结节形成(图3)。地塞米松+鹿瓜多肽注射液组、对照组组钙结节的面积、数量多。

钙结节计数结果表明，地塞米松+鹿瓜多肽注射液组、对照组的钙结节数目均高于地塞米松组(P < 0.01)，说明地塞米松组中成骨细胞的分化能力受到影响，而地塞米松+鹿瓜多肽注射液组中无明显影响。地塞米松+鹿瓜多肽注射液组、对照组之间差异无显著性意义(P > 0.05，表1)。

参考文献

[1]Seeman E, Delmas PD. Bone qualitydthe material and structural basis of bone strength and fragility. Engl J Med. 2006;354:22.50-61.
[2]Zhou XW,Liu YC,Jian XC. Effects of osteoporosis on oral and maxillofacial bone. Chin J Clin Rehabil. 2005;9(11):248-249.
[3]Him T, Ishijima T,Hashikawa Y,et al.Osteoporosis and reduction of residual ridage in edentulous patients.J Prosthet Dent. 1993;69(1):49-56.
[4]Derbis E.Oralimplications of osteoporosis.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2005;100(3):349-356.
[5]Rodan,GA, Martion TJ. Therap eutic approaches to bone diseases. Science. 2000;289(5484):1508-1514.
[6]Chen XD,Shi S,Xu T,et al.Age-related osteoporosis in biglycan deficient mice is related to defects in bone marrow stromal cells. J Bone Miner Res. 2002;17(2):331-340.
[7]Miura M,Chen XD,Allen MR,et al.A crucial role of caspase-3 in osteogenic differentiation of bone marrow stromal stem cells. J Clin Invest. 2004;114(12):1704-1713.
[8]Ishida Y,Heersehe JN. Glueoeortieoidinduced osteoPorosis:both in vivoandinvitro Eoncentrations of glueoeortieoids higher than Physiological levels attenuate osteoblast Differentiation .J Bone Miner Res. 1998 ;13(12): 1822-1861.
[9]Vaanaen KH,Hakonen PL.Bone effeets of glucocorticoid therapy. Emst Sehering Res Found Workshop. 2002;(40): 55-64.
[10]Chen YJ, Tracey J, Nickola, et al. Dexamethasone-Mediated Repression of MUC5AC Gene Expression in Human Lung Epithelial Cells. Cell Mol Biol. 2006;34(3): 338-347.
[11]陆茂,叶俊儒,张云光,等. 鹿瓜多肽注射液治疗糖皮质激素性骨质疏松症的疗效观察[J].当代医学,2008,15(8):145-147.
[12]赵正旭,郝毅,茹选良．鹿瓜多肽注射液治疗原发性骨质疏松症疗效观察[J].中国骨与关节损伤杂志,2006,6(11):500-501．
[13]高晓新,翟文生,王和枚,等. 大鼠腹腔注射鹿瓜多肽重复给药13周毒性病理评价[J].中国药理学与毒理学杂志,2013,6(3): 530-531.
[14]林文鑫．鹿瓜多肽的药理作用和临床应用[J]．实用全科医学杂志,2006,4(6):730-733.
[15]章静波, 张世馥, 黄东阳. 组织和细胞培养技术[M].北京:人民卫生出版社, 2002:96-98.
[16]Kern B, Shen J, Starbuck M, et al. Cbfa1 contributes to the osteoblastspecifi cexpression of type I collagen genes. J Biol Chem. 2001;276(10):7101-7107.
[17]Janknecht R. Regulation of the c-fos promoter. Immunobiology. 1995;193(2-4):137-142.
[18]Wagner EF. Functions of AP1 (Fos/Jun) in bone development. AnnRheum Dis. 2002;61:ii40-22.
[19]Hauschka PV. Osteocalcin: the vitamin K-dependent Ca2+- binding protein of bone matrix. Haemostasis. 1986;16(3-4): 258-272.
[20]Nojima N, Kobayashi M, Shionome M, et al. Fibroblastic cells derived from bovine periodontal ligaments have the phenotypes of osteoblasts. Periodontal Res.1990; 25(3): 179-185.
[21]徐西强,李峰,李昆鹏,等.鹿瓜多肽注射液对大鼠成骨细胞增殖及分化影响[J]. 中国中医骨伤科杂志,2011, 19( 9):6-9.
[22]王丽红,何英,徐永柱. 鹿瓜多肽联合 hBMP-2 基因对软骨细胞增殖和Ⅱ型胶原分泌的影响[J].中国老年学杂志,2011,5(31): 1577-1580.
[23]扬林,陶天遵,刘枫晨,等.地塞米松对成人成骨细胞增殖和分化影响的实验研究[J]中华骨科杂志, 2001, 21(8): 493.
[24]周先培,倪江东. 不同浓度地塞米松对大鼠干细胞体外诱导分化成骨细胞的影响[D].中南大学，2005.
[25]Weinstein RS, Jilka RL,Parfitt AM, et a.l Inhibition of osteoblastogenesis and promotion of apoptosis ofosteoblasts and osteocytes by glucocorticoids. Potentialmechanisms of theirdeleterious effects on bone. Clin Invest. 2008;102(2):274.
[26]郭世绂,罗先正,邱贵兴.骨质疏松基础与临床[M].天津:天津科学技术出版社, 2001: 384.
[27]Qu Q, Perala-Heape M, Kapanen A,et al. Estrogen enhances differentiation of osteoblasts in mouse bone marrow culture. Bone. 1998;22(3):201-209.
[28]Owen TA, Aronow M, Shalhoub V, et al. Progressive development of the rat osteoblast phenotype in vitro:reciprocal relationships in expression of genes associated with osteoblast proliferation and differentiation during formation of the bone extracellular matrix. J Cell Physiol. 2010;143(3):420-430.
[29]Majors AK, Boehm CA, Nitto H, et al. Characterization of human bone marrow stromal cells with respect to osteoblastic differentiation. J Orthop Res. 1997;15(4):546-557.
[30]Stanford CM, Jacobson PA, Eanes ED, et al. Rapidly forming apatitic mineral in an osteoblastic cell line (UMR 106-01 BSP). J.Biol Chem. 1995;270(16):420-456.
[31]贺茂林,肖增明. 糖皮质激素性骨质疏松症的研究进展[J]. 中国骨质疏松杂志,2009,15(6):466-470.
[32]李春香,刘红,徐艳,等. 唑来膦酸治疗糖皮质激素性骨质疏松症的临床观察[J].中国骨质疏松杂志,2013,19(12):1262-1264.
[33]孔德诚,王莉,白人骁,等.糖皮质激素引起骨质疏松的发病机制及其防治措施[J].中国骨质疏松杂志,1999,5(3):70-72
[34]王剑,郑洪新,刘研,等. 补肾益髓中药复方对糖皮质激素性骨质疏松症大鼠肾组织Osterix mRNA及蛋白表达的影响[J].光明中医,2012,27(4):673-677.
[35]王剑,郑洪新,刘瑞辉,等. 补肾中药复方对糖皮质激素性骨质疏松症大鼠骨和肾组织Dlx5 mRNA及蛋白表达的影响[J].中华中医药杂志,2012,23(4):951-856.
[36]何淼泉,徐莉,范永升. 中医药调控糖皮质激素性骨质疏松症机制研究[J].浙江中西医结合杂志,2012,22(4):329-331
[37]黄春雷,吴斌. 吸入糖皮质激素治疗支气管哮喘与骨质疏松的研究进展[J]. 国际呼吸杂志,2011,31(15):1190-1194.
[38]张国哲,郑洪新,朱辉,等. 补肾中药对糖皮质激素性骨质疏松大鼠脂类代谢异常的调节作用[J].辽宁中医药大学学报,2011, 13(6): 53-56.
[39]李洪涛,于雪峰,李登宇,等. 糖皮质激素性骨质疏松症发病机理研究进展[J]. 中国骨质疏松杂志,2009,15(2):150-152.
[40]徐晓东,邓洋洋,郑洪新. 糖皮质激素诱导肾虚骨质疏松症大鼠骨组织中OPG/RANKLmRAN及蛋白表达的影响[J]. 中华中医药学刊,2013,32(12):2623-2627.

引言

骨质疏松症是一个全身性疾病，它不但从微观结构上表现为骨量减少，而且还表现在骨的脆性增加，增加了骨折的风险^[1] 。研究发现全身发生骨质疏松时，颌骨也发生骨质疏松化的改变^[2] 。近年来研究表明，骨质疏松的严重程度与剩余牙槽脊高度成显著负相关，同时剩余牙槽脊高度女性显著低于男性^[3] 。越来越多的证据表明，骨质疏松症的患者颌骨骨质疏松的风险增大，发生牙周疾病的概率也随之增大^[4] ，而且骨质疏松与牙周疾病和牙齿丧失常同时伴发，严重危害人们的口腔健康。对于骨质疏松的发生，近年来不少学者提出是因为骨改建过程中成骨功能与破骨功能的失调所引起^[5] 。成骨细胞在骨骼发育与重建过程中的作用也逐渐受到重视。研究发现，二聚糖基因敲除导致小鼠成骨细胞凋亡增加和增殖减弱，进而导致进行性的骨质疏松^[6] ；细胞凋亡蛋白酶通过抑制成骨细胞的增殖和分化而加速骨质疏松的发生过程^[7] ；老年人群的成骨细胞增殖以及分化功能都有不同程度的减退，与骨质疏松的表现相一致。
地塞米松注射液为临床上常用的糖皮质激素类药物，其长期的使用导致糖皮质激素性骨质疏松症是最常见的并发症之一，其发病机制当前还不清楚，没有有效的治疗方法。地塞米松注射液是一种人工合成的糖皮质激素药物，临床中较为常见，是治疗类风湿性关节炎、抗感染以及自身免疫性疾病的有效药物，其对骨的形成和代谢有复杂的刺激作用，长期大剂量的使用也会对骨的形成和代谢起到一定的抑制作用^[8-9] ，与氢化可的松相比地塞米松糖皮质激素受体的结合能力更强，地塞米松是在氢化可的松基本结构的基础上合成的糖皮质激素，其疗效增强。同时地塞米注射液也可以预防和治疗某些药物产生的细胞毒素^[10] 。
鹿瓜多肽注射液是葫芦科植物冬瓜的干燥成熟种子和梅花鹿的骨骼分别提取后制成的灭菌水溶液。临床上用于早期风湿、类风湿关节炎、骨折愈合、骨关节炎、腰腿疼痛和创伤恢复等。实验研究发现，长时间使用糖皮质激素诱导的大鼠骨质疏松，鹿瓜多肽注射液能有效预防^[11-12] 。大鼠腹腔注射鹿瓜多肽注射液重复给药13周的实验表明鹿瓜多肽注射液对大鼠毒性较轻^[13] 。鹿瓜多肽注射液主要含有骨诱导多肽、甜南瓜肽、游离氨基酸和多种有机钙、磷等元素，其中骨诱导多肽能有效地促进人体骨形态发生蛋白、转化生长因子β、成纤维细胞生长因子等影响骨形成和骨吸收衍生生长因子的合成，参与骨代谢的调节，在促进新骨形成的同时，抑制骨的吸收，从而增加骨质疏松症患者的骨密度。研究表明，鹿瓜多肽注射液可以提高原发性骨质疏松症患者骨密度。长时间使用糖皮质激素诱导的大鼠骨质疏松，鹿瓜多肽注射液也可以有效的预防^[14] 。
为了观察鹿瓜多肽注射液治疗糖皮质激素引起骨质疏松症的分子机制，文章应用特定浓度的地塞米松注射液(1×10^-7 mol/L)和鹿瓜多肽注射液(8 mg/L)，观察其对体外培养成骨细胞增殖和分化的影响，以期为预防糖皮质激素诱导的骨质疏松症提供理论基础。

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材料方法

设计：细胞学水平，对比观察实验。

时间及地点：于2013年4至10月在佳木斯大学实验楼细胞实验室完成。

材料：

实验方法：
大鼠成骨细胞培养与传代：本实验按照以往文献所述的方法进行培养和传代^[15] ：①当瓶底细胞浓度达到70%-80%时进行传代。②弃去原培养基培养液，加入到预先加热至37 ℃的PBS 2 mL冲洗2次。③加入细胞消化液1 mL，消化2 min，立即加含2 mL含血清DMEM培养基中终止反应，移液至15 mL的离心管中。④800 r/min转离心5 min。⑤弃上清液，加入3 mL DMEM培养基，均匀吹打制成细胞悬液，体积分数5%CO₂，37 ℃恒温培养箱中开放培养。在显微镜下观察细胞生长当细胞形成单层，铺满培养瓶底部的70%-80%时进行传代培养，用体积分数75%乙醇擦拭消毒培养瓶瓶壁后，将烧瓶移到清洁台上，倒掉原培养液，用PBS洗涤3次，加入0.25%胰蛋白酶1 mL，倒置相差显微镜下观察细胞，当细胞开始收缩圆形，细胞间连接松散后，立即弃去消化液，加入2 mL生长培养基终止消化。反复轻吹打至细胞脱落形成悬浮液，避免出现气泡，以及免损伤细胞。将细胞转移至离心管中，1 000 r/min下离心5 min，弃去上清液，加入到2 mL的生长培养基中，均匀吹打，使细胞重新悬浮，培养基第2天换液。本实验采用第3-5代细胞，即通过进一步纯化和保持细胞最大原始生物学特性。
骨钙素mRNA表达的测定：
实验分组和处理：二甲基亚砜为广泛应用的溶剂和反应试剂，被称为万能溶剂。根据实验的惟一变量原则分组如下：将纯化的成骨细胞1×10⁹L^-1培养于24孔培养板中，随机分为3组，每组3份。地塞米松+鹿瓜多肽注射液组添加1×10^-7 mol/L地塞米松注射液，8 mg/L鹿瓜多肽注射液和终浓度为1 g/L的二甲基亚砜；地塞米松组添加与地塞米松+鹿瓜多肽注射液组等量的二甲基亚砜及1×10^-7 mol/L的地塞米松注射液；对照组只添加与地塞米松+鹿瓜多肽注射液组等量的二甲基亚砜，培养96 h，每48 h更新换液。
骨钙素mRNA测定：取上述地塞米松+鹿瓜多肽注射液组、地塞米松组、对照组细胞，用TrizolReagent试剂提取细胞中的总RNA，然后将提取到总RNA按照反转录试剂盒要求反转录得到cDNA，以cNDA作为模板对其进行扩增。将其扩增的产物用于水平琼脂糖凝胶电泳实验, 实验结果用凝胶成像分析系统测量及计算目的条带与β-actin吸光度的比值。
钙结节形成的测定：茜素红染色的工作原理为茜素红染色剂与细胞中沉积的钙发生显色反应，细胞基质中的钙被染成橘红色，而细胞本身被染成粉红色。选用优质胎牛血清培养液将成骨细胞以浓度1×10⁹L^-1接种于24孔培养板上，将培养板放置在37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱恒温24 h后，将地塞米松+鹿瓜多肽注射液组、地塞米松组、对照组随机分布于9孔，每孔0.2 mL，各占3孔。每 48 h换液1次，14，21 d后分别用PBS冲洗2次，体积分数95%乙醇固定15 min，双蒸水冲刷3次。0.1%茜素红染液Tris-HCl(pH 8.3)染色，37 ℃条件下孵育30 min后用蒸馏水冲洗，干燥，封固。以橘红色结节、边界清楚椭圆形、圆形、形状大小不一、或形状不规则的沉着物为标准，光镜下观察上述地塞米松+鹿瓜多肽注射液组、地塞米松组、对照组细胞钙结节形成情况。
主要观察指标：96 h后以RT-PCR分析骨钙素的表达，14，21 d后观察钙结节的表达量。
统计学分析：实验数据以x(_)±s表示，所有数据用SPSS 17.0软件处理，图像由Image-Pro Plus处理分析，数据比较采用单因素方差分析和q 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

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讨论

随着人口日益老龄化，老龄化社会已经到来，骨质疏松症以及骨质疏松症所带来的相关疾病，目前已迅速的成为危害人体健康重要问题之一。地塞米松注射液作为最常用的肾上腺皮质激素类药物目前正在广泛的应用于多种临床疾病的治疗，其主要的治疗作用包括抗炎、抗过敏、免疫抑制、抗风湿以及抗病毒等。临床常被称为“万能药”，而广泛及长期的使用而引起的骨质疏松症发病率逐渐升高，然而临床中对这种骨质疏松症尚没有确切的治疗方法，鹿瓜多肽注射液为常用的促进骨折愈合、提高骨密度的药物。本实验希望通过探讨鹿瓜多肽注射液对在高浓度地塞米松条件下对成骨细胞的增殖与分化的影响，从而为预防及治疗糖皮质激素所引起的骨质疏松症提供理论依据。
成骨细胞为骨形成的过程中重要功能细胞，其主要功能的是承担骨基质的合成、骨基质的分泌以及矿化。破骨细胞的主要功能是负责分泌酸性物质溶解矿物质以及蛋白酶继而消化骨基质，被溶解的骨基质在成骨吸收后会形成陷窝，此时成骨细胞移行至被吸收部位，发挥其功能促进新骨的形成。而破骨与成骨过程中形成的这种动态平衡是维持正常骨量及骨密度值的关键。
根据本实验RT-PCR的结果可以观察到目的产物的相应表达情况，从mRNA水平上证实了骨钙素mRNA的表达。成骨细胞的骨钙素是由成骨细胞合成和分泌的，维持正常骨的矿化速度是成骨细胞骨钙素的主要生理作用，其在成骨过程中相对稳定，不受骨吸收因素的影响。所以通过测定骨钙素可以了解成骨细胞，特别是新的活跃的成骨细胞形成。骨钙素值随成骨细胞更新率的变化而不同。骨更新率越快，骨钙素值越高，反之降低[16]。骨钙素与成骨细胞的增殖、分化及其成熟紧密相关，也常被视为反映细胞功能活动的重要标志^[17-18] 。骨钙素是骨依赖维生素K蛋白，是参与Ca2+与羟磷灰石的结合以及促进骨质矿化过程中不可缺少的必要成分^[19] 。Nojima等^[20]研究认为骨钙素可作为检测成骨细胞的可靠的重要的标志之一，骨钙素标志着成骨细胞的成熟，是在成骨细胞晚期分化时所产生的标志性蛋白。本实验中所用的鹿瓜多肽注射液可以促进大鼠成骨细胞的增殖与分化^[21] ，同时鹿瓜多肽可以对软骨细胞的增殖分化起促进作用^[22] 。对比地塞米松+鹿瓜多肽注射液组与对照组骨钙素mRNA的表达量可以证明地塞米松+鹿瓜多肽注射液组中骨钙素mRNA的表达并未受到高浓度地塞米注射液所带来的抑制作用。而地塞米松组的表达量明显受到高浓度地塞米注射液的抑制作用。
以往实验表明，在人骨骼重建时, 适当浓度的糖皮质激素地塞米松注射液可促进成骨细胞中骨钙素mRNA表达和细胞的增殖与分化，促进人体骨髓干细胞分化为成骨细胞，并且抑制破骨细胞。而1×10^-7 mol/L的地塞米松则是超生理剂量的糖皮质激素起抑制作用^[23-24] 。长期使用高剂量的皮质类固醇，减少骨组成的成骨细胞的活跃性，从而导致骨形成减少，使成骨细胞不能正常募集骨表面，而破骨细胞的成骨细胞吸收骨面没有得到维修，造成骨损失，最终导致骨质疏松^[25] 。但由于糖皮质激素引起的骨质损失的形成主要是抑制新骨形成，所以，对糖皮质激素引起的骨质疏松症，关键在于刺激新骨形成，从而促进骨量增加^[26] 。而地塞米松+鹿瓜多肽注射液组与对照组实验的结果说明鹿瓜多肽注射液可以抵消高浓度地塞米松注射液的抑制作用。
大量研究表明，体外形成矿化结节是成骨细胞的一个重要特性，徐西强等[21]的研究证实鹿瓜多肽注射液同样可以促进钙结节的表达。钙结节是由成骨细胞细胞外基质矿化而形成。该过程为成骨细胞分化的最后阶段，包括胶原的沉积，细胞外基质的矿化两个重要过程。钙结节的形成是成骨细胞的重要特性之一，由成骨细胞经过长时间诱导所形成矿化产物^[27] 。也是成骨细胞成熟的早期重要标志，代表了成骨细胞的分化成熟[28]。对钙结节的观察鉴定多采用茜素红染色法。茜素红染色可以直接反应成骨细胞的矿化能力，同时也属于成骨细胞钙结节的特异性染色^[29-30] 。本文结果显示，地塞米松+鹿瓜多肽注射液组与对照组成骨细胞的分化能力明显高于地塞米松组。
在本实验中，地塞米松组高浓度的地塞米松注射液对成骨细胞起抑制作用，成骨细胞中骨钙素mRNA的表达和成骨细胞钙结节的表达明显受到高浓度地塞米松注射液的抑制，而骨钙素mRNA的表达及钙结节的表达下调，表明可能是成骨细胞增殖率降低的重要发生机制。而地塞米松+鹿瓜多肽注射液组、对照组成骨细胞骨钙素mRNA的表达和钙结节的表达表明鹿瓜多肽注射液可对抗高浓度地塞米松条件下地塞米松对成骨细胞的增殖和分化的抑制作用，从而使成骨细胞骨钙素mRNA及钙结节的表达明显高于地塞米松组，骨钙素mRNA的表达及钙结节的表达上调可能是成骨细胞增殖率增加的重要发生机制。由于糖皮质激素引起骨质损失的形成主要是抑制新骨形成，所以对于此类骨质疏松症主要在于刺激新骨的生成，促进骨量的增加^[31-40] 。
作者认为，鹿瓜多肽注射液可用于预防长期使用地塞米松注射液而导致糖皮质激素骨质疏松症的发生，这对于临床上预防此类骨质疏松症提供了一种新的有效的方法和理论。至于在鹿瓜多肽注射液中这些特定的细胞因子，哪种因子可以激活的信号通路对抗高浓度地塞米松注射液对成骨细胞增殖和分化的抑制作用，还有待进一步探讨。

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